Home

Gdy na początku drugiej połowy dwudziestestego wieku wraz z opisaniem struktury DNA zaczęła się szybko rozwijać genetyka, było tylko kwestią czasu, kiedy badacze zaczną sobie stawiać pytanie: a co by było, gdybyśmy potrafili wyredagować genom? Czy bylibyśmy w stanie wbudować w organizm obce geny? Dzisiaj wiemy oczywiście, że jest to możliwe. Stało się zresztą możliwe względnie szybko: enzymy restrykcyjne odkryto już w latach 70., a pozwoliły nam one na bardzo, bardzo wiele.

Bakteryjny korektor

Enzymy restrykcyjne to białka, które tną DNA w specyficznych punktach – rozpoznają one określone krótkie sekwencje nukleotydów. Enzymy te występują w bakteriach i archebakteriach. W ciągu ostatnich 40 lat opisano ponad 3000 takich białek; ponad pół tysiąca jest standardowo stosowane w badaniach i dostępne komercyjnie.

Jak zatem wykorzystuje się te enzymy do wbudowywania w genomy genów innych organizmów? Ilustruje to grafika poniżej. Do sekwencji, którą chcemy wbudować w genom np. bakteryjny lub grzybi, dołączone są odcinki komplementarne z miejscem cięcia enzymu restrykcyjnego. Reguła komplementarności zasad azotowych robi za nas resztę roboty.

Sposób działania enzymów restrykcyjnych.

Sposób działania enzymów restrykcyjnych.

Enzymy restrykcyjne umożliwiły rozwój technologii klonowania molekularnego. Początkowo stosowano je do określania kolejności genów na chromosomach (pamiętajmy, że mówimy tu wciąż o latach siedemdziesiątych!), do analizy chemicznej struktury genów oraz regionów DNA odpowiedzialnych za ich regulację, czy wreszcie do tworzenia nowych kombinacji genów. Każda współczesna publikacja opisująca klonowanie genów jednego organizmu i ich ekspresję w innych organizmie (najczęściej w drożdżach lub E.coli jako modelowych jednokomórkowcach), opiera się na tych właśnie enzymach.

Pomimo jednak tego, że enzymy restrykcyjne pozwoliły nam pobawić się przez moment w boga, wycinając, mieszając i składając geny z powrotem do kupy, zabawa ta jednak pozostaje wciąż na poziomie przedszkolnym. Istnieją bowiem poważne ograniczenia ich zastosowania. Po pierwsze, enzymy restrykcyjne nadają się świetnie do manipulacji genomów w prostych organizmach, z niewielką ilością materiału genetycznego. Wynika to z tego, że rozpoznawane przez nie sekwencje są zazwyczaj dość krótkie, więc im większy genom, tym większa szansa, że miejsce ciętych przez dany enzym będzie więcej – a to z kolei oznacza utratę kontroli nad procesem. Po drugie zaś, jeśli nie znany jest enzym rozpoznający określoną sekwencję w genomie, to manipulacja w obrębie takiej sekwencji pozostaje poza naszym zasięgiem. I to stało się poniekąd Świętym Graalem (jednym z wielu) biologii molekularnej – znalezienie sposobu na machinacje w genach tam, gdzie chcemy, a nie tylko tam, gdzie pozwala nam technologia.

Projekt na start

W okolicach początku lat dziewięćdziesiątych badacz o niełatwym do wymówienia nazwisku, Srinivasan Chandrasegaran, który dopiero co został asystującym profesorem (odpowiednik naszego docenta) na Uniwersytecie Johnsa Hopkinsa, poszukiwał dobrego projektu na start nowego labu. Spytał więc swojego mentora, Noblistę Hamiltona Smitha, jakie jego zdaniem byłby dobry projekt badawczy, który nowej grupie zająłby pierwsze pół dekady? Taki, żeby i paru doktorów na nim wychować, a i imię sobie w świecie na własnym wyrobić. Smith zaś zaproponował wyzwanie nie lada: projekt enzymów restrykcyjnych, które potrafiłyby ciąć w nowych miejscach.

Chandrasegaran postanowił badania rozpocząć od poszukiwania enzymów restrykcyjnych, w których domeny odpowiedzialne za rozpoznawanie sekwencji DNA i ich cięcie byłyby niezależne – to bowiem pozwoliłoby mu na manipulację jednym aspektem enzymu, bez wpływania na drugi. Wśród komercyjnie dostępnych enzymów znalazł dwa spełniające to kryterium – do dalszych badań wybrał FokI. Udało mu się domenę FokI o aktywności nukleazy (czyli tnącej DNA) połączyć z nowymi domenami rozpoznającymi DNA. Wybór, po etapie prób i błędów, padł na nukleazy z motywem palców cynkowych (ang. zinc finger nucleases, ZFN). U ludzi, i innych ssaków, tych nukleaz są setki – a charakteryzują się tym, że wiążą różne, specyficzne dla siebie, sekwencje DNA w sposób zależny od ilości i budowy cynkowych palców (każdy palec rozpoznaje jedną trójnukleotydową sekwencję). Tak więc w sposób naturalny tworzą one katalog enzymów rozpoznających ssacze DNA – katalog, który teraz pozostało wykorzystać łącząc poszczególne nukleazy ZNF z domeną tnącą FokI.

Pierwszy w ten sposób stworzony enzym restrykcyjny, oparty o nukleazy ZFN, został opisany w pracy opublikowanej w 1996 roku w amerykańskim interdyscyplinarnym tygodniku PNAS. I przez kolejne 15 lat nukleazy ZFN były optymalizowane i z powodzeniem stosowane do manipulowania genomami rośli (modelowej Arabidopsis, tytoniu, kukurydzy) oraz zwierząt (nieśmiertelnej muszki owocówki, szczurów, myszy, żab, królików, bydła). Stosowano je także w badaniach na komórkach ludzkich. Poczytne miejsce znalazły na przykład w badaniach nad terapiami genowymi, w których chodzi właśnie o to, co te enzymy umożliwiają – o dokładne, precyzyjne redagowanie genomu.

Słoniowy problem

Jak jednak mówi jeden z badaczy pracujących w tej dziedzinie, pomimo rosnącej lawinowo liczby publikacji potwierdzających skuteczność tej metody, „there is an elephant in the room” (to angielski uroczy odpowiednik stwierdzenia, że niestety, Houston, mamy problem): dla przeciętnej grupy badawczej, które chce nukleazy Zfn tylko stosować, a nie wdawać się w ich konstrukcję, zbudowanie działającego enzymu jest nie lada wyzwaniem. Dlatego większości pozostaje korzystanie – znowuż, jak w przypadku zwykłych enzymów restrykcyjnych – z tego, co jest dostępne komercyjnie lub w ramach współpracy z innymi placówkami.

Dlaczego budowa nukleaz ZFN jest tak trudna? Pomimo stworzenia nowych możliwości redakcji genomu, enzymy te wciąż nie potrafią rozpoznawać wszystkich dowolnych sekwencji, o jakich tylko moglibyśmy zamarzyć. Z przyczyn technicznych chętniej wiążą się do odcinków DNA bogatych w guanozynę (wynika to z tego, że oddziaływania pomiędzy zawartą w białku argininą a guanozyną są szczególnie stabilne). Ten wymóg obecności litery G jest jednak sporym ograniczeniem.

Coraz bliżej Graala

W 2011 roku Nature Methods opublikowało trzy bardzo podobne prace opisujące nowy rodzaj nukleaz, tzw. TALENy (z ang. Transcription activator-like effector nucleases, nie będę jednak próbował tłumaczyć na polski). Podczas gdy w nukleazach ZFN za rozpoznawanie sekwencji DNA odpowiedzialne były palce cynkowe (i każdy, przypomnę, rozpoznawał sekwencje 3 nukleotydów), w TALENach każda poddomena TALE rozpoznaje pojedynczy nukleotyd:

Porównanie nukleaz ZFN i TALENów. /źródło: wiki (zmodyfikowane)

Porównanie nukleaz ZFN i TALENów. /źródło: wiki (zmodyfikowane)

Z jednej strony, o TALENach wiemy mniej i gorzej rozumiemy ich działanie w porównaniu z nukleazami ZFN. Z drugiej zaś, poddomeny TALE są znacznie łatwiejsze do zaprojektowania niż odpowiednie palce cynkowe, co może oznaczać, że po prostu łatwiej będzie te enzymy zaprojektować i prawdopodobnie będą one działać nieco lepiej – nawet jeśli nie do końca będziemy wiedzieli czemu.

TALENy w 2011 roku okazały się wielkim sukcesem: Nature Methods, pismo, jak sama nazwa wskazuje, poświęcone publikacji najlepszych nowych metod, obwołało je Metodą Roku 2011. Za tą nagrodą przyszło rozpoznanie w postaci kolejnych prac wykorzystujących nową technikę – a miarą jej sukcesu powinno być to, że znalazła się także na liście 10 odkryć roku 2012 skompletowanej przez tygodnik Science w grudniu (miejsca pierwszego nie zdobyła – ale chyba nikt nie wątpił, że to przypadnie bozonowi Higgsa). W ciągu niecałych dwóch lat od pierwszych publikacji o TALENach nukleazy wykorzystano m.in. do badań na ludzkich pluripotencjalnych komórkach macierzystych, a także do redagowania genomów myszy, szczurów i ryb danio.

I chociaż badacze rzucili się z zapałem na TALENy, a firmy zajmujące się produkcją reagentów zacierają ręcę i rozmyślają nad tym, jakby tu skapitalizować potencjał nowych enzymów, droga przed nami jest jeszcze do Graala dość daleka. Jednak odkąd Srinivasan Chandrasegaran pokazał nam to nowe podejście: rozdzielenie domeny rozpoznającej i domeny tnącej sekwencje DNA i manipulowanie nimi z osobna, łatwiej jest szukać nowych rozwiązań. Do gry weszły też tzw. meganukleazy, a ostatnio opisany po raz pierwszy w sierpniu 2012 roku w piśmie Science system oparty na bakteryjnych sekwencjach CRISPR.

Zwłaszcza system oparty na CRISPR wydaje się być bardzo obiecujący.W systemie tym za rozpoznawanie określonych sekwencji DNA odpowiada fragment CRISPR właśnie, który sam – chemicznie – jest kwasem nukleinowych. Zatem zdolność tego systemu do rozpoznawania DNA jest uzyskiwana na poziomie kwasów nukleinowych, bez potrzeby tworzenia modyfikowanych enzymów. Jedyna enzymatyczna część w tym systemie to enzym Cas9 – który jednak pozostaje ten sam, niezależnie od sekwencji docelowej. Wygląda też na to, że system ten jest równie skuteczny, co nukleazy ZFN oraz TALENy.

Słowo ostrzeżenia

Warto może jednak na koniec podkreślić, że minie jeszcze trochę czasu zanim którąkolwiek z tych metod zastosuje się u ludzi (chociaż trwają pierwsze próby kliniczne z nukleazą ZFN do leczenia z HIV). Z prostej przyczyny: nie wiemy, jak bardzo specyficzne są te metody. A jeśli czegoś byśmy nie chcieli, to tego żeby okazało się, że nasze DNA jest cięte nie tam, gdzie planowaliśmy – nie jesteśmy w stanie nawet przewidzieć, do czego doprowadziłoby wbudowanie jakiegoś fragmentu DNA do naszego genomu (zależy oczywiście gdzie). Nikt jednak raczej nie zaryzykuje w przypadku błędu najgorszego z wyroków – bo tutaj tym wyrokiem byłaby najprawdopodobniej śmierć.

Przypisy:

1. Gene-editing nucleases (2012), M. Baker, Nat Methods 9:23-36

2. Hybrid restriction enzymes: zinc finger fusions to Fok I cleavage domain (1996), Y.G. Kim, J. Cha, S. Chandrasegaran, PNAS 93(3): 1156-60

3. Zinc-finger nucleases: how to play two good hands (2012), M. Isalan, Nat Methods 9:32-34

4. Primer: genome editing with engineered nucleases (2012), N. de Souza, Nat Methods 9:27

5. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity (2012), M. Jinek, K. Chylinski, I. Fonfara, M. Hauer, J.A. Doudna, E. Charpentier Science 337(6096): 816-21

Autor: Rafał Marszałek, nicprostszego.pl

Reklamy

2 thoughts on “Geny na miarę

  1. Pingback: Naukowe podsumowanie roku 2013 | nic prostszego

  2. Pingback: Waga profilaktyki HIV wśród grup ryzyka | nic prostszego

Skomentuj

Wprowadź swoje dane lub kliknij jedną z tych ikon, aby się zalogować:

Logo WordPress.com

Komentujesz korzystając z konta WordPress.com. Wyloguj / Zmień )

Zdjęcie z Twittera

Komentujesz korzystając z konta Twitter. Wyloguj / Zmień )

Zdjęcie na Facebooku

Komentujesz korzystając z konta Facebook. Wyloguj / Zmień )

Zdjęcie na Google+

Komentujesz korzystając z konta Google+. Wyloguj / Zmień )

Connecting to %s